在本系列文章（一）中，我们围绕以慢病毒为代表的病毒递送体系，梳理了in vivo CAR-T疗法中，体内递送场景下面临的多个核心技术问题，包括靶向特异性、免疫原性、T细胞活化以及安全性等。为了适应“体内递送”这一应用场景，领域内玩家往往需要围绕病毒载体开展一系列复杂的工程化改造，并围绕不同改造方案建立了专利壁垒。
与此同时，另一种递送策略也正在in vivo CAR-T疗法中快速发展——以脂质纳米颗粒（LNP）为代表的非病毒递送体系。
LNP技术的兴起，与核酸药物的发展几乎同步。随着siRNA、mRNA等核酸类疗法逐渐进入大众视野，如何将这些“天然并不适合在体内稳定存在的分子”有效递送至目标细胞，成为领域内关注的核心问题。在这一背景下，由脂质体系包裹核酸载荷介导体内递送的技术路线开始受到关注，并逐步发展形成了如今的LNP平台。
相较于慢病毒载体，LNP载体并不依赖衣壳或包膜等结构完成递送，因此在免疫原性、可重复给药、生产工艺以及载荷灵活性等方面，通常展现出与病毒载体不同的技术特点。尤其在mRNA疫苗推动LNP递送平台快速成熟之后，LNP在体内核酸递送效率、稳定性以及产业化生产方面的可行性得到了进一步验证。
在此基础上，基于LNP递送的in vivo CAR-T逐渐成为近年来细胞治疗领域的重要技术路线之一。然而，在体内递送场景中相对成熟的LNP技术并不意味着“技术难度降低”，当LNP被应用到in vivo CAR-T场景时，同样需要面对一系列新的技术问题，主要包括：体内分布调控、免疫细胞靶向、表达持续时间控制等。
（改编自 doi.org/10.1038/s41573-025-01291-5）
LNP在In vivo CAR-T中的主要改造方向与专利布局考量
体内分布调控
在in vivo CAR-T场景中，LNP递送体系面临的核心问题之一，在于其天然具有较强的肝脏富集倾向。早期LNP技术大多适用于肝脏相关疾病或肝脏靶向的小核酸药物递送，然而，对于in vivo CAR-T而言，其目标细胞通常为T细胞等免疫细胞，主要分布于脾脏、淋巴结及外周循环中。这意味着，LNP需要从原本“天然偏向肝脏”的递送特性，调整为向免疫相关组织富集，并进一步提高对目标免疫细胞的递送效率。
LNP的体内分布特性（biodistribution）可能受到其整体组成的影响，包括阳离子脂质结构、各脂质组分比例以及表面修饰方式等因素。因此，在in vivo CAR-T等体内递送场景中，领域内的重要技术创新方向也逐渐集中于：新型阳离子脂质结构的高通量筛选或设计、LNP组分比例的优化调整，以及额外功能性脂质组分的开发（例如，形成五组分系统），以实现对LNP组织嗜性的改造。
而在专利布局的层面，针对新型的阳离子脂质结构本身、脂质体系的组分配等角度的改造，通常会针对相应的改造角度进行单独的专利保护。
例如，ReNAgade Therapeutics通过高通量阳离子脂质筛选，获得了具有肝外递送能力（提高免疫相关组织递送能力）的阳离脂质分子，并于PCT/US2022/076430家族成员中针对筛选所得新型阳离子脂质结构进行保护。而同样使用LNP作为递送载体的Capstan Biotherapeutics，围绕阳离子脂质分子结构布局了多个专利家族（PCT/US2023/017647、PCT/US2024/049627、PCT/US2024/049649等），对不同的新型阳离子脂质通式结构进行保护，可能对应其在阳离子脂质方面的系统性优化与技术迭代。
免疫细胞靶向递送
In vivo CAR-T对于LNP递送体系提出了更高的细胞特异性要求。CAR分子的功能发挥本身具有明确的细胞依赖性：只有当CAR（常规CAR分子结构）成功表达于T细胞等效应免疫细胞表面时，才能进一步介导对肿瘤细胞的识别与杀伤。而当LNP能够更多地富集于脾脏等免疫相关组织后，其仍然会同时暴露于当量其他免疫细胞，例如被巨噬细胞、树突状细胞等摄取。
在这一背景下，如何进一步提高LNP对目标免疫细胞的识别与结合能力，形成靶向LNP（t-LNP），同样是领域内重要的研究方向。目前，较为常见的策略是在LNP表面引入能够识别目标免疫细胞的抗体或其他靶向分子。例如，已有研究尝试使用anti-CD3、anti-CD4、anti-CD5、anti-CD7、anti-CD8以及针对α4β7、β7等整合素的抗体分子对LNP进行表面修饰，以提高其与目标细胞之间的结合与递送效率。
从具体实现方式来看，目前许多t-LNP体系，通常会进一步引入带有活性基团的PEG-lipid衍生物（例如maleimide-PEG-lipid），以实现抗体或其他靶向分子的共价偶联。相较于普通LNP，此类体系的一个重要区别，也在于其PEG-lipid部分通常不仅承担“隐身”与稳定化作用，还进一步作为靶向分子的连接平台。
（源自doi.org/10.1021/acs.nanolett.5c05535）
相应地，在专利布局层面，针对t-LNP体系的保护，往往围绕体系中的关键改造模块进行重点保护。以Capstan Biotherapeutics针对主动靶向改造的相关专利布局为例，一部分专利会优先针对PEG脂质本身的结构进行保护，以PCT/US2023/017648专利申请家族为例，其权利要求中，一方面对PEG-lipid的脂质部分进行了限定；另一方面，则进一步对PEG末端基团进行限定，其中既包括普通非功能化基团，也包括能够进一步连接靶向分子的功能化基团，例如maleimide、DBCO、alkynyl等。实际上，在t-LNP体系中，仅有部分PEG-lipid承担靶向分子的连接作用，因此，该类PEG-lipid结构专利的保护范围，通常能够同时覆盖“连接靶向分子的PEG-lipid”与“普通PEG-lipid”两类体系。
而聚焦到PEG脂质的靶向部分，如果该靶向部分为抗体或抗体片段，那么其本质其实是抗体-抗原表位的特异性结合，因此如果该靶向序列本身具有新颖性，则可以尝试针对抗体序列进行单独的保护，例如PCT/US2024/060426专利申请家族。
（源自DOI: 10.1126/science.ads8473）
有效载荷的选择或优化
当LNP载体能够实现有效进入目标细胞后，另一个重要的问题同样需要考虑，那就是LNP所包裹的有效载荷该如何选择或优化。在体内递送的场景下，CAR的表达过程直接发生于患者体内，这使得LNP体系需要关注其表达效率、表达持续时间、安全性以及可控性之间的平衡，因此，其有效载荷的选择不仅需要实现CAR的有效表达，还需要兼顾安全性。例如，过短的CAR表达时间可能导致疗效不足，而过长的持续表达则可能增加免疫毒性或长期安全性风险。
目前，mRNA仍然是LNP型载体中主流的载荷形式。一方面，mRNA无需进入细胞核，不存在基因整合的风险；另一方面，其表达的持续时间相对有限或相对可控，也较为符合体内CAR表达对于安全性的要求。
然而，未经优化的天然mRNA通常稳定性较差，容易被快速降解，同时还可能激活TLR等固有免疫识别通路，从而严重影响CAR的表达效率。因此，围绕mRNA本身的工程化改造，依然在LNP递送CAR分子时适用。例如，通过对5’ cap结构、UTR区域、polyA长度以及密码子进行优化，可以提高mRNA的翻译效率与表达稳定性；而通过N1-methyl-pseudouridine等核苷修饰，则能够降低先天免疫激活水平并延长表达时间。
进一步地，除线性mRNA外，circRNA（circular RNA）也是体内递送CAR分子时的一个重要选择。与传统线性mRNA相比，circRNA不存在5’与3’末端，因此通常具有更高的稳定性，并能够在一定程度上延长蛋白表达时间。这一特性使其与in vivo CAR-T场景具有较好的适配性，即在避免长期基因组整合风险的同时，获得相对更持久的CAR表达能力。
（源自https://www.ornatx.com/our-approach-strategy/）
针对mRNA本身的工程化改造，例如上述所列举的改造手段，其从原理上的适用范围往往并不局限于编码CAR分子的情况。因此，许多针对mRNA结构本身的优化策略，本质上属于一种更具平台属性的技术，相应地，在专利布局层面，往往可以优先围绕工程化改造本身进行保护。
例如，针对特定UTR设计、核苷修饰方式、RNA结构优化等建立基础专利保护，而不一定在初始阶段即限定于编码CAR的场景。随后，可以再进一步结合in vivo CAR-T的具体应用场景，围绕特定CAR payload、免疫细胞递送体系等方向进行组合式专利布局，从而形成覆盖平台型技术与具体应用场景的专利布局体系。
PCT/US2018/065836的两件授权同族成员US10953033B2与US11844759B2，即体现了上述先针对核心发明点单独保护，后考虑结合特定领域进行组合保护的思路。其中，较早的US10953033B2，首先围绕环状RNA实现体内持续表达这一工程化改造本身进行保护，其权利要求重点在于：通过特定circRNA结构实现至少7天以上的体内表达，其核心并不在于表达CAR，而在于“利用特定RNA结构实现持续表达”这一具有平台属性的技术。而后续的US11844759B2，则进一步结合in vivo CAR-T场景，在前述平台型技术基础上，进一步限定例如表达对象为CAR、LNP作为递送体系，其保护范围则对应到了in vivo CAR-T治疗场景。
对应于专利布局策略的专利风险考量
根据上述对于LNP载体在in vivo CAR-T应用场景下主要创新点及其对应专利布局策略的梳理（总结见图5），相应地，LNP载体体内递送CAR分子的专利侵权风险，也很可能主要来源于领域内围绕上述创新点所建立的专利布局。
而从宽泛的专利风险角度来看，LNP型载体本身作为相对成熟的递送平台，其部分早期宽泛专利（例如Arbutus的宽泛组分配比专利家族PCT/CA2009/000496等的基础专利）在in vivo CAR-T产品真正进入商业化阶段时，可能已陆续到期。因此，对于LNP体系的FTO排查而言，当前更需要重点关注的，往往并非经典LNP这一概念本身，而是具体脂质组分层面的专利风险；但与此同时，针对相对较新的tLNP体系，以及tLNP应用于CAR等新型体内递送场景所形成的潜在宽泛专利风险，同样不能忽视。
另一方面，LNP体系中的潜在宽泛风险，也可能并不直接来源于LNP本身，而是来源于有效载荷相关的底层平台技术。例如，mRNA中的核苷修饰、UTR优化、cap结构、circRNA设计等方向，均存在一定范围的平台型基础专利。尤其是在mRNA工程化改造已经高度平台化的背景下，即使不同产品所编码的蛋白完全不同，也仍可能因底层RNA工程改造策略相同而落入相应专利保护范围。此外，若in vivo CAR-T进一步结合基因编辑等跨领域技术，还需要同步关注对应技术领域内的基础平台专利风险，而不应仅局限于CAR或LNP领域本身。
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